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一、实验目的

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二、实验原理

1.细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代。悬浮型细胞直接分板即可，而贴壁细胞需经消化后才能分板（所以说今天分的这个293T细胞和HepG2细胞都是铁壁细胞了）。

HepG2，人肝癌细胞，来源于一个15岁的白人男性肝癌患者，常用于研究肝脏疾病发病机理及其临床应用。
HepG2属于贴壁细胞，显微镜下呈上皮样，易抱团生长，生长较快，可分泌多种血浆蛋白，如清蛋白、血纤维蛋白溶酶原等。HepG2细胞不携带乙肝病毒基因组，适合作为转染宿主，但在免疫抑制小鼠中成瘤率较差。
HepG2细胞常用DMEM培养基，含10%胎牛血清，在37度、5% CO2培养箱中培养。HepG2对培养条件要求较严格，特别是 pH 值和血清质量，否则可能影响细胞凝集数量，需要使用高质量低内毒素胎牛血清，有利于促进圆形细胞丛簇更好的贴壁及形成单层细胞。
HepG2细胞内容易产生空泡，特别是在融合时，细胞复苏后也可能存在形态不典型的情况，但一般经过几次传代，细胞形态会更加典型稳定，建议传代比例为1:2至1:4，37度胰酶消化2-3分钟。Hep G2细胞内容易产生空泡，属正常现象，多传代几次后，细胞形态更加典型稳定
另需注意：HepG2细胞消化时,细胞易从培养皿上成片脱落，需用机械力吹散成单细胞悬液，否则影响后续细胞贴壁和生长。
培养的HepG2形态不太理想，可考虑添加1%NEAA（NEAA指的是非必须氨基酸），对于细胞状态会有所改善。正常情况下，HD加10%FBS的培养条件即可（这个HD是啥不是很懂？？？）。

一些网友的讨论： 1.养这个细胞的时候有的时候会有很多的黑点点，如果这些黑点点是会动的话，可能就是黑胶虫，可以用黑胶虫试剂进行处理。 2.HepG2这个细胞的转染的效率是有点低的。

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三、实验材料

1. 细胞：贴壁细胞株
2. 试剂：0.25％胰酶、PBS (pH7.4)、培养基（含 10％血清+1%双抗）
3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

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四、实验方法及步骤

准备工作：

提前 20-30min 用酒精棉球擦拭超净工作台，将所需枪头、EP 管、PBS、细胞培养板、废液桶等放入超净工作台，将超净工作台的紫外灯打开进行紫外灭菌 20min，同时将所需培养基于 37℃水浴锅预热（只有这个用到的细胞培养基才需要提前加热）。操作过程中所有拿进超净工作台的物品均需要 75%酒精喷拭。实验结束后，酒精棉球擦拭台面，废液桶内废弃物以及要处理的培养皿等要用消毒水浸泡后再丢弃。

实验步骤：

1. 吸除 10cm 培养皿内旧培养液。
2. 加入 5mL PBS 润洗一遍后，吸除 PBS。
3. 向瓶内加入 0.25%胰酶 1-2mL，以能覆满培养皿为限，所以说这个其实就是随缘就好。
4. 置室温 1~5min，当发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大后，立即终止消化。
5. 吸除消化液，向培养皿中加入 1-2mL 培养基，轻轻反复吹打细胞，使之脱离形成细胞悬液。
6. 计算细胞总数，分 2-4×10⁶ 个细胞到新的已加 10mL 培养基的 10cm 培养皿中，摇匀后，放入培养箱。细胞计数方法详见下节细胞计数，不同培养板的孔底面积及推荐加液量见附表。

注：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在 2-3mm 范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。可获细胞数与细胞类型及细胞密度相关，以上只是参考细胞数，根据具体实验要求灵活选用细胞培养板。

实验步骤：（师姐的实验步骤）

1. 吸除 10cm 培养皿内旧培养液。
2. 加入 5mL PBS 润洗一遍后，吸除 PBS。
3. 向瓶内加入 0.25%胰酶 1-2mL，以能覆满培养皿为限，所以说这个其实就是随缘就好。
4. 吸除消化液，向培养皿中加入 5mL 培养基，轻轻反复吹打细胞，使之脱离形成细胞悬液。
5. 取12孔板和24孔板，先向每个孔板中加入1ml的对应细胞的培养基，然后师姐按照师兄说的每个孔加入50ul的细胞悬液，这样的话就成功将细胞稀释了100倍。

注意事项：

1. 操作前带好手套，进入超净台前手要用 75%酒精擦拭。
2. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
3. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
4. 吸溶液的吸管等不能混用。
5. 实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。

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五、实验注意事项

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六、讨论与总结

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